基于尾氣分析的真菌生物量實(shí)時(shí)估算
 

　　Julian Kager, Peter Sinner, Holger Müller, Christoph Herwig
 

　　摘要
 

　　生物量濃度的實(shí)時(shí)信息，對(duì)所有生物過程的穩(wěn)定控制都至關(guān)重要。本應(yīng)用報(bào)告中，利用 BlueSens 氣體分析儀技術(shù)測(cè)得的尾氣中 CO?與 O?濃度數(shù)據(jù)，對(duì)產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中的生物量濃度進(jìn)行了精準(zhǔn)估算。該估算方法結(jié)合了實(shí)時(shí)尾氣檢測(cè)、真菌生物量生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)建模與粒子濾波算法三大技術(shù)。采用此方法，可實(shí)現(xiàn)生物量濃度的連續(xù)在線監(jiān)測(cè)，平均預(yù)測(cè)誤差僅為 3.0%。基于該信號(hào)，不僅可以實(shí)現(xiàn)過程的在線監(jiān)管，還能對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給進(jìn)行精細(xì)化控制，從而在維持產(chǎn)品高品質(zhì)的同時(shí)，顯著降低原料消耗，并提升發(fā)酵過程的整體穩(wěn)定性。
 

　　引言
 

　　從機(jī)理層面理解生物過程，并在過程中持續(xù)獲取關(guān)鍵信息，是生物過程理性開發(fā)與控制的基礎(chǔ)。這類信息有助于滿足美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)在《過程分析技術(shù)(PAT)指南》(2004 年)中提出的產(chǎn)品質(zhì)量保障要求，同時(shí)支撐 “質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(QbD)” 原則(2009 年)的落地實(shí)施。然而，生物量濃度這類關(guān)鍵過程變量的測(cè)量一直存在挑戰(zhàn)：離線實(shí)驗(yàn)室分析耗時(shí)冗長(zhǎng)，而現(xiàn)有的在線傳感器(如光散射、透射探頭)不僅僅在有限的濃度范圍內(nèi)有效，還高度依賴其他過程參數(shù)。
 

　　突破上述局限的一種具前景的方案，是使用所謂的軟傳感器。該技術(shù)通過將過程的數(shù)學(xué)模型與現(xiàn)有測(cè)量數(shù)據(jù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)過程變量的實(shí)時(shí)估算。在簡(jiǎn)單的場(chǎng)景中，生物量的生成可直接與菌體的呼吸活性關(guān)聯(lián) —— 呼吸活性可通過 BlueSens 氣體分析儀測(cè)得的 攝氧率(OUR)和二氧化碳釋放率(CER)來(lái)表征。而對(duì)于真菌菌絲生長(zhǎng)這類非均勻生物量生長(zhǎng)場(chǎng)景，構(gòu)建軟傳感器還需引入狀態(tài)觀測(cè)器算法(Ali 等人，2015 年)。這類算法(包括經(jīng)典的卡爾曼濾波和新興的粒子濾波)基于貝葉斯原理，可通過系統(tǒng)數(shù)學(xué)模型與部分測(cè)量數(shù)據(jù)，估算出系統(tǒng)最可能的狀態(tài)。本應(yīng)用報(bào)告將闡述如何通過 BlueSens 測(cè)得的 O?與 CO?數(shù)據(jù)，結(jié)合粒子濾波算法，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)黃青霉生物量濃度的估算。
 

　　工作原理與實(shí)現(xiàn)
 

　　本研究采用結(jié)構(gòu)化模型描述產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)的生長(zhǎng)與青霉合成行為。該模型的結(jié)構(gòu)示意圖見圖 1，其數(shù)學(xué)描述基于 Kager 等人(2018)與 Paul 等人(1998)的研究成果。模型中，菌絲生長(zhǎng)過程通過以下參數(shù)表征：不同底物(S1、S2)利用下，菌絲頂端(A0)的分支速率(rb)、延伸速率(re)，以及向菌絲體(A1)的分化速率(rd)。菌體生長(zhǎng)過程中消耗氧氣(rO2)并產(chǎn)生二氧化碳(rCO2)，這一過程可通過尾氣分析進(jìn)行定量檢測(cè)。
 

　　圖 1：菌絲生長(zhǎng)與青霉合成數(shù)學(xué)模型的示意圖
 

　　在發(fā)酵過程運(yùn)行時(shí)求解模型，可計(jì)算出攝氧率(OUR，rO2)與二氧化碳釋放率(CER，rCO2)的理論信號(hào)(y^)。將其與根據(jù) Aehle 等人(2011)方法計(jì)算得到的 CER、OUR 實(shí)測(cè)值(y)進(jìn)行對(duì)比，即可獲取當(dāng)前模型有效性的信息。結(jié)合測(cè)量與模型的不確定性信息，可通過濾波程序計(jì)算出系統(tǒng)最可能的狀態(tài)。本研究所用粒子濾波的原理如圖 2 所示。粒子濾波是一種序貫蒙特卡洛方法，通過樣本空間中大量帶權(quán)重的點(diǎn)(“粒子”)來(lái)近似得到最可能的培養(yǎng)狀態(tài)，這些粒子在已知的過程噪聲與測(cè)量噪聲中演化。
 

　　在對(duì)每個(gè)粒子進(jìn)行時(shí)間推進(jìn)后，可篩選出與實(shí)測(cè)狀態(tài)(yt+1)高度匹配的粒子(y^t+1)。由于可測(cè)狀態(tài)(y = CER 和 OUR)是其他不可測(cè)狀態(tài)(y^ = f (A0, A1))的函數(shù)，因此可從篩選后的粒子分布中得到最可能的估計(jì)值。
 

　　圖 2：粒子濾波原理，其中狀態(tài)分布由表示為點(diǎn)的粒子近似，并根據(jù)其與測(cè)量分布(yt)的匹配度進(jìn)行篩選。從篩選后的粒子中，可推導(dǎo)出狀態(tài)估計(jì)值(x)。
 

　　為實(shí)現(xiàn)上述軟傳感器的實(shí)時(shí)應(yīng)用，本研究在 BlueVis 軟件、反應(yīng)器系統(tǒng)(30 L Techfors；Infors AG，瑞士)與數(shù)值計(jì)算軟件(MATLAB R2017b；Mathworks，美國(guó))之間建立了雙向 OPC 連接。數(shù)據(jù)每 30 秒導(dǎo)入 MATLAB 一次。除尾氣數(shù)據(jù)外，基于稱重信號(hào)的補(bǔ)料速率以及基于質(zhì)量流量控制器數(shù)據(jù)的氣體流量，也需作為粒子濾波的輸入數(shù)據(jù)。圖 3 展示了系統(tǒng)整體架構(gòu)。本研究采用基于 bootstrap 算法(Gordon 等人，1993)的粒子濾波方法(粒子數(shù)為 500)，對(duì)不可直接測(cè)量的生物量濃度進(jìn)行估算。
 

　　圖 3：產(chǎn)黃青霉補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中，基于尾氣數(shù)據(jù)進(jìn)行生物量狀態(tài)實(shí)時(shí)估算的系統(tǒng)設(shè)置概述。
 

　　采用工業(yè)產(chǎn)黃青霉菌株的孢子懸液，在攪拌式生物反應(yīng)器中進(jìn)行分批與補(bǔ)料分批發(fā)酵。分批階段結(jié)束后，收集菌體，向反應(yīng)器中加入 11 L 滅菌合成培養(yǎng)基，并以 160 mL L-1 的接種量接入分批培養(yǎng)的發(fā)酵液。培養(yǎng)過程中，通過攪拌轉(zhuǎn)速(350-800 rpm)控制溫度為 25 ℃、pH 為 6.5、溶解氧濃度保持在 40% 以上。空氣質(zhì)量流量控制器(Voegtlin GmbH，瑞士)將通氣量控制在 1 vvm。以葡萄糖(500 g L-1)和苯氧乙酸(160 g L-1)作為補(bǔ)料溶液。工藝的更多細(xì)節(jié)見 Posch 和 Herwig，2014。每 12 小時(shí)取樣一次，采用重量法測(cè)定生物量干重，采用 HPLC(Agilent ZORBAX C-18 色譜柱)測(cè)定青霉與苯氧乙酸濃度，所有測(cè)定均做三次平行。尾氣由 BlueSens 氣體分析儀(BlueSens GmbH，德國(guó))檢測(cè)，其中 O?采用 ZrO?傳感器，CO?采用紅外傳感器。
 

　　結(jié)果與討論
 

　　針對(duì)高密度產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)過程，進(jìn)行了生物量的實(shí)時(shí)估算。如圖 4 和圖 5 所示，引入 BlueSens 尾氣分析儀的實(shí)時(shí) CO?與 O?數(shù)據(jù)后，模型輸出的 CER 與 OUR 值得到了調(diào)整，與實(shí)測(cè) CER 和 OUR 值的偏差顯著降低。通過上述粒子濾波算法的濾波過程，可在發(fā)酵運(yùn)行過程中利用尾氣測(cè)量數(shù)據(jù)對(duì)模型輸出進(jìn)行校正。
 

　　圖 6 對(duì)比了采用濾波估算得到的生物量結(jié)果與未進(jìn)行任何自適應(yīng)調(diào)整的純模型模擬結(jié)果。特別是在發(fā)酵前 45 小時(shí)，未引入尾氣數(shù)據(jù)的模型模擬結(jié)果與離線實(shí)測(cè)生物量存在顯著差異，模型誤差為 1.42 g L-1，對(duì)應(yīng)的歸一化均方根誤差(NRMSE)為 5.7%。而基于尾氣數(shù)據(jù)進(jìn)行濾波后，生物量狀態(tài)估算誤差降低了約 50%，估算誤差僅為 0.75 g L-1，對(duì)應(yīng)的 NRMSE 為 3.0%。
 

　　圖 4：產(chǎn)黃青霉補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中二氧化碳釋放率(CER)的變化曲線，對(duì)比實(shí)測(cè)值(灰色點(diǎn))、引入實(shí)時(shí)尾氣數(shù)據(jù)的模型預(yù)測(cè)值(藍(lán)色點(diǎn))與未引入尾氣數(shù)據(jù)的模型預(yù)測(cè)值(橙色線)。
 

　　圖 5：產(chǎn)黃青霉補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中攝氧率(OUR)的變化曲線，對(duì)比實(shí)測(cè)值(灰色點(diǎn))、引入實(shí)時(shí)尾氣數(shù)據(jù)的模型預(yù)測(cè)值(藍(lán)色點(diǎn))與未引入尾氣數(shù)據(jù)的模型預(yù)測(cè)值(橙色線)。
 

　　圖 6：產(chǎn)黃青霉補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中生物量干重的變化曲線，對(duì)比實(shí)測(cè)值(灰色點(diǎn))、引入實(shí)時(shí)尾氣數(shù)據(jù)的模型預(yù)測(cè)值(藍(lán)色點(diǎn))與未引入尾氣數(shù)據(jù)的模型預(yù)測(cè)值(橙色線)。
 

　　工業(yè)應(yīng)用價(jià)值
 

　　基于 BlueSens 的尾氣分析技術(shù)結(jié)合過程模型，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)培養(yǎng)狀態(tài)(如生物量生成、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗)的精準(zhǔn)、連續(xù)估算。
 

　　這對(duì)工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義：基于這些連續(xù)估算數(shù)據(jù)進(jìn)行決策和過程控制，可使工藝更高效、更穩(wěn)定。
 

　　正如 Biwer 等人 2005 年的報(bào)道，原材料與起始物料成本是發(fā)酵工藝的主要成本。因此，本研究提出的方法已成功應(yīng)用于大型工業(yè)生產(chǎn)設(shè)施，旨在基于連續(xù)的生物量估算結(jié)果控制葡萄糖與前體的添加。該方案的成功實(shí)施帶來(lái)了顯著的成本節(jié)約，并提升了工藝穩(wěn)定性：具體而言，因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)添加錯(cuò)誤導(dǎo)致的批次失敗率降低，整體原材料消耗減少，同時(shí)發(fā)酵過程的產(chǎn)品質(zhì)量也得到了維持。
 

　　參考文獻(xiàn)
 

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