摘要
本文提出一種基于二氧化碳的替代方法，可突破傳統(tǒng)離線pH測量方式的局限，不受各現(xiàn)場取樣離線pH測量操作流程的影響，實(shí)現(xiàn)全球可比對的pH數(shù)值。在無細(xì)胞培養(yǎng)基體系下，當(dāng)生物反應(yīng)器內(nèi)二氧化碳通入量與移除量相等時(shí)，體系pH保持穩(wěn)定，氣液兩相之間二氧化碳凈傳質(zhì)為零。此時(shí)，氣相二氧化碳濃度不再受傳質(zhì)動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)影響，因此具備規(guī)模無關(guān)性。
引言
過去數(shù)十年，發(fā)酵工藝的放大、縮小以及工藝轉(zhuǎn)移工作主要聚焦于工程層面。
但對于細(xì)胞培養(yǎng)工藝，僅依靠上述工程參數(shù)，尚不足以保證大小規(guī)模之間pCO?、乳酸濃度、生長速率、補(bǔ)堿量，以及最終產(chǎn)物濃度與質(zhì)量屬性的可比性。而pH、溶解氧這類參數(shù)不受設(shè)備與場地限制，通常由對應(yīng)的控制回路進(jìn)行維持。pH對工藝表現(xiàn)至關(guān)重要，在工藝放大中同樣意義重大。
目前生物反應(yīng)器探頭的監(jiān)測與校正，仍依賴取樣后離線pH讀數(shù)。但樣品pH會(huì)受多種因素影響：二氧化碳脫氣、溫度、懸浮細(xì)胞整體呼吸作用等，取樣后樣品pH會(huì)與反應(yīng)器真實(shí)pH產(chǎn)生偏差。此外，離線測量結(jié)果還會(huì)受探頭類型與老化程度、培養(yǎng)基性質(zhì)、日常校正流程、響應(yīng)時(shí)間、操作人員等因素干擾。
而這些偏差恰恰來源于離線取樣pH測量本身，無法通過該手段檢測與量化。依靠取樣離線pH測量，很難達(dá)到所需精度，無法實(shí)現(xiàn)高效工藝轉(zhuǎn)移所必需的跨場地pH直接比對。
為降低工藝波動(dòng)與潛在質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，提升故障排查、工藝放大與工藝轉(zhuǎn)移效率，必須開發(fā)一種能夠識別常規(guī)手段無法檢出的pH偏差的方法。
研究背景
行業(yè)通用的離線pH測量，需要從生物反應(yīng)器取樣，再使用各類設(shè)備方法測定樣品pH。發(fā)酵工藝中，滅菌后的內(nèi)置探頭，通常依據(jù)離線測量數(shù)值完成校正。受方法本身、操作流程差異、二氧化碳脫氣、溫度下降、細(xì)胞持續(xù)代謝等因素影響，偏差不可避免。不同廠區(qū)之間離線pH測量偏差最高可達(dá)0.3，造成工藝轉(zhuǎn)移困難，需要耗費(fèi)大量時(shí)間與成本開展故障排查。
圖 1：以二氧化碳?xì)怏w作為酸性 pH 校正劑的 pH 控制標(biāo)準(zhǔn)裝置
本文提出的新方案(圖2)利用尾氣CO?數(shù)據(jù)，能夠消除離線pH測量引入的各類偏差；接種前無需取樣即可完成反應(yīng)器內(nèi)置pH探頭校正。CO?信號直接對應(yīng)在線探頭信號，進(jìn)而與pH控制器聯(lián)動(dòng)。
圖2：基于尾氣參比法的先進(jìn)pH控制方案
方法原理
為克服離線測量帶來的偏差問題，可以利用氣相二氧化碳與液相質(zhì)子活度(由pH表征)之間的化學(xué)關(guān)聯(lián)。根據(jù)亨德森哈塞爾巴爾赫方程：在相同培養(yǎng)基中，溫度、壓力、pH一致時(shí)，氣相二氧化碳濃度必然相同。
該化學(xué)關(guān)聯(lián)不受傳質(zhì)相關(guān)參數(shù)影響；達(dá)到平衡狀態(tài)(pH、溫度、壓力恒定)時(shí)體系凈傳質(zhì)為零，因此具備普適性，即與反應(yīng)器規(guī)模無關(guān)。因此，生物反應(yīng)器尾氣中的CO?水平可用來間接判斷反應(yīng)器內(nèi)部pH是否處于目標(biāo)區(qū)間，不必全依賴本身存在缺陷的離線pH取樣測量。
原理驗(yàn)證
小試實(shí)驗(yàn)在2?L反應(yīng)器開展，采用集成BlueSens傳感技術(shù)的GA4尾氣分析儀(德國Eppendorf)。2?L、100?L、400?L、10000?L規(guī)模實(shí)驗(yàn)同時(shí)使用GA4與BlueInOne尾氣分析儀(德國BlueSens)。
圖3展示細(xì)胞培養(yǎng)基在不同工作體積(對應(yīng)不同vvm)下的pH與尾氣CO?濃度，實(shí)驗(yàn)改變P/V、kLa、槳葉線速度，攪拌轉(zhuǎn)速最高1500?rpm；對比帶擋板與無擋板罐體，還分別采用單攪拌槳、雙攪拌槳研究攪拌的影響(相關(guān)數(shù)據(jù)本文未展示)。
圖3：不同體積細(xì)胞培養(yǎng)液下尾氣二氧化碳濃度與pH的相關(guān)性
即便在1500?rpm這類攪拌條件下，尾氣CO?與pH的對應(yīng)關(guān)系依然保持不變。對比頂空通氣與底部浸沒通氣，除達(dá)到平衡的時(shí)間存在差異外，二者無其他區(qū)別。
為驗(yàn)證規(guī)模無關(guān)性，將實(shí)驗(yàn)工藝放大至更大體積。圖4對比2?L玻璃反應(yīng)器與100?L、400?L不銹鋼反應(yīng)器結(jié)果，為完成該對比，對內(nèi)置pH探頭重新校準(zhǔn)，并將pH控制器偏差調(diào)至最??；實(shí)驗(yàn)中P/V、kLa、槳葉線速度、裝液體積、vvm、攪拌器構(gòu)型均未保持恒定。
圖4：生物反應(yīng)器尾氣的pH值與對應(yīng)二氧化碳濃度
結(jié)果明確證明：尾氣CO?與pH的對應(yīng)關(guān)系保持不變，該關(guān)聯(lián)不受反應(yīng)器規(guī)模以及上述各類操作參數(shù)影響。在其他條件全一致的前提下，乳酸濃度可以作為pH的指示信號。
采用玻璃電極離線取樣法、尾氣CO?基準(zhǔn)法得到相同pH設(shè)定點(diǎn)時(shí)，對內(nèi)置探頭重新校準(zhǔn)后，反應(yīng)器內(nèi)部實(shí)際pH并不相同；取樣和離線測量會(huì)引入固有偏差。 研究對比兩種校準(zhǔn)方式下乳酸的波動(dòng)情況，乳酸是胞外培養(yǎng)基中非常理想的pH指示物：pH越高，CHO細(xì)胞會(huì)通過乳酸質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)體分泌更多乳酸。因此在其余條件可比的前提下，對比乳酸水平，就可以識別由pH帶來的工藝波動(dòng)。
圖5：同等實(shí)驗(yàn)條件下，采用取樣離線測量pH(橙色曲線)，乳酸水平存在差異。若采用基于尾氣的pH參比方法評估pH并校正生物反應(yīng)器探頭，在同一pH設(shè)定值下，乳酸水平幾乎全一致(綠色與紅色曲線)。
圖5展示最長200?h工藝周期內(nèi)，乳酸作為pH指示信號的變化；全程僅內(nèi)置pH探頭的校準(zhǔn)方式不同，就能觀察到顯著差異。綠色柱代表基于尾氣CO?的pH基準(zhǔn)方法，橙色柱代表傳統(tǒng)離線pH測量。該2?L實(shí)驗(yàn)在彭茨貝格的非GMP項(xiàng)目開發(fā)平臺完成。
結(jié)論
本文提出一種簡單、非侵入式方法，利用尾氣CO?間接監(jiān)測、控制無細(xì)胞體系的pH。借助該方法，可以在工藝轉(zhuǎn)移、放大、縮小過程中，在不同工廠、場地、反應(yīng)器規(guī)模之間精準(zhǔn)匹配初始pH。
故障排查效率得到提升；后續(xù)批次可識別并建立跨批次pH可比性。該方法給出明確判定依據(jù)，可排除pH偏差作為工藝異常來源。最終降低生產(chǎn)批次間波動(dòng)，提升工藝可比性；研發(fā)階段波動(dòng)顯著下降，工藝開發(fā)效率提高。
總而言之，該方法可以規(guī)避有缺陷的離線取樣pH讀數(shù)帶來的異常工藝風(fēng)險(xiǎn)。對于碳酸鹽緩沖體系，這套基于尾氣的pH基準(zhǔn)方案，簡單經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)、穩(wěn)定性強(qiáng)，能夠檢出傳統(tǒng)手段無法發(fā)現(xiàn)，但實(shí)際存在的pH偏差。
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